Formazan adalah senyawa kimia dengan rumus umum [R−N=N−C(R')=N−NH−R"], secara formal merupakan turunan dari formazan [H₂NN−CHN=NH], yang tidak diketahui dalam bentuk bebasnya.^[1]

Zat warna formazan adalah produk kromogenik buatan yang diperoleh melalui reduksi garam tetrazolium oleh dehidrogenase dan reduktase. Zat warna ini memiliki berbagai warna, dari biru tua hingga merah tua hingga jingga, tergantung pada garam tetrazolium asli yang digunakan sebagai substrat untuk reaksi tersebut.

Formazan adalah senyawa yang sangat berwarna yang dicirikan oleh struktur berikut: [−N=N−C(R)=N−NH−], dan sangat terkait dengan zat warna azo ((−N=N−)).^[2] Strukturnya pertama kali didefinisikan pada tahun 1892 oleh von Pechmann dan oleh Bamberger dan Wheelwright secara independen.^[3][4] Warna pekat dan kimia redoks berasal dari kerangka kaya nitrogennya.^[5]

Formazan memiliki fleksibilitas tautomerik dan konformasi yang tinggi.^[5] Karena dua ikatan ganda bergantian dalam kerangka, formazan dapat ada dalam empat bentuk isomer yang mungkin: sin, s-cis (bentuk tertutup); sin, s-trans (bentuk terbuka); anti, s-cis; dan anti, s-trans (bentuk linier).^[6]

Formazan 1,5-disubstitusi dapat ada sebagai dua tautomer (1 dan 2 pada gambar di bawah). Setelah deprotonasi, anion yang terbentuk (3) distabilkan oleh resonansi. Dengan ion logam transisi (Cu²⁺, Co³⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, dll.), formazan membentuk kompleks (kelat) yang sangat berwarna.

Karena kemampuannya untuk bereaksi dengan asam dan basa kuat, formazan dapat dianggap amfoter.^[7]

Oksidasi senyawa tersebut menghasilkan konversinya menjadi garam tetrazolium yang tidak berwarna. Di antara berbagai oksidan yang digunakan adalah raksa oksida, asam nitrat, isoamil nitrit, N-bromo suksinimida, kalium permanganat, timbal tetra-asetat dan t-butil hipoklorit.^[8] Tergantung pada kondisinya, garam tetrazolium dapat direduksi untuk membentuk radikal tetrazolil atau formazan:

Terdapat berbagai metode sintesis untuk sintesis formazan.^[8][9]

Reaksi senyawa diazonium dengan aldehida hidrazona adalah salah satu prosedur paling umum untuk menghasilkan formazan. Hidrazona, yang merupakan senyawa kaya elektron, bereaksi dengan garam diazonium baik pada atom nitrogen atau karbon untuk menghasilkan formazan. Garam diazonium berikatan dengan nitrogen amina dalam hidrazona dengan penggantian hidrogen untuk menghasilkan zat antara, yang kemudian mengalami penataan ulang menjadi formazan.^[10]

Bentuk lain untuk disintesis Formazan dapat dihasilkan melalui reaksi senyawa metilena aktif dengan garam diazonium. Garam diazonium berikatan dengan senyawa metilena aktif untuk membentuk senyawa azo perantara, diikuti dengan penambahan garam diazonium kedua (dalam kondisi yang lebih basa), menghasilkan tetrazena, yang kemudian membentuk formazan tersubstitusi-3.

Formazan juga dapat dihasilkan melalui oksidasi hidrazidina yang sesuai, biasanya disiapkan melalui reaksi halida hidrazonil dengan turunan hidrazina yang sesuai. Misalnya, etil format atau ortoformat bereaksi dengan dua ekuivalen fenilhidrazina untuk menghasilkan 1,5-difenilformazan, dalam kondisi asam. Dalam kondisi basa, etil nitrat bereaksi pada posisi metilena untuk menghasilkan 3-metil-1,5-difenilformazan, yang juga dapat diperoleh dari reaksi fenilazoetana dengan isoamil nitrit.

Selain itu, formazan dapat diperoleh melalui dekomposisi garam tetrazolium tersubstitusi baik secara fotokimia maupun di bawah pengaruh asam askorbat dalam medium alkali.^[11]

Garam tetrazolium dan produk formazannya banyak digunakan dalam metode histokimia, terutama dalam asai viabilitas kolorimetri.^[12] Prosedur ini didasarkan pada reduksi tetrazolium oleh enzim dehidrogenase mitokondria, yang dibawa di dalam sel hidup:

Contoh utama garam tetrazolium yang paling banyak digunakan meliputi:^[13]

• INT atau 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolium klorida, yang tidak larut dalam air.
• MTT atau 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolium bromida, yang tidak larut dalam air dan digunakan dalam asai MTT.
• XTT atau 2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolium-5-karboksanilida, yang larut dalam air.
• MTS atau 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium, yang larut dalam air dan digunakan dalam asai MTS.
• TTC atau tetrazolium klorida atau 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolium klorida, yang larut dalam air.
• NBT digunakan dalam uji diagnostik, khususnya untuk penyakit granulomatosa kronis dan penyakit lain yang memengaruhi fungsi fagosit.

Ketika direduksi dalam sel, baik secara enzimatik atau melalui reaksi langsung dengan NADH atau NADPH, garam tetrazolium klasik, MTT, berubah warna menjadi biru hingga ungu dan dapat membentuk endapan yang tidak larut.^[14][15] Pewarna formazan ini umumnya digunakan dalam asai proliferasi sel dan toksisitas seperti uji EpiDerm dan EpiSkin karena hanya mewarnai sel hidup yang aktif secara metabolik.^[16][17]